動物ウィルス株編

ATCCには、組換え能力のあるレトロウイルス（RCR）標準品がありますか?

はい。ATCC No.VR-1450です。VR-1450は細胞を含まない標準品で、さらにVR-1448は、生育能力のある細胞に持続的に感染する標準品です。

Does ATCC have recombinant competent retrovirus (RCR) standards?

Yes. The ATCC number is VR-1450. VR-1450 is a cell free supernatant, while VR-1448 is persistently infected viable cells.

凍結乾燥品のウィルス抗血清が1mlのH2Oに溶解できなかった場合はどうしたらよいですか?

ほとんどの血清は、すべて高い力価を有しております。1mlでの溶解が困難であれば、5mlに希釈していただくことも可能です。

What should I do if lyophilized virus antisera I purchased does not dissolve in the recommended 1 ml of water?

Most of these antisera are very high titer. Those that do not dissolve well in 1 ml can be diluted to 5 ml.

注文したウィルス株が細胞に対して、CPE（cytopathic effect）を示さなかったのですが、何か問題があるのでしょうか?

商品添付のプロダクトシートには、想定されるCPEや、継代履歴があれば掲載されています。もしATCCから入手したウィルスが、感染させて培養された経験のない細胞で御利用を検討されている場合には、何度か継代させて適応させる必要があるでしょう。もし可能であれば、これまでに増幅させた経験のある手法で培養し増幅させてから、新しい手法でお試しいただくことを推奨いたします。

The virus I ordered did not produce CPE on cells. Is there a problem with it?

The product sheet sent with each virus lists the expected CPE, if any, and the passage history. If the virus you obtained through ATCC has never been passaged in the cell line you are using, it may require several passages to adapt. If possible, it is best to start with a system in which the virus has recently been propagated, and then try the virus in the new system.

ウィルスプロダクトシートに記載されている力価TCID₅₀は、どう解釈したら良いのですか?

ほとんどのウィルス株に対してATCCより提供されている力価は、言いかえれば細胞に対する感染能力であり、単層培養された細胞の50%を感染させることのできる感染原（ウィルス溶液）の定義です。力価が[10³(TCID₅₀)/0.2ml, MK, 2 days]と記載されている場合、0.2mlのウィルス溶液を1:1000で希釈したものをサルの腎臓細胞（MK）を含む4つの試験管へ加え、2本が感染を示し、他の2本は感染していない状態であることを示します。

How should I interpret the TCID₅₀ titers listed on the virology product sheets?

The titer given by ATCC for most animal viruses is in terms of the tissue culture infectious dose which will infect 50% of the cell monolayers challenged with the defined inoculum (TCID₅₀). If the titer is "10³ TCID₅₀/0.2 ml, MK, 2 days," it means that when a 0.2 ml inoculum of a 1:1,000 dilution of the virus is added to each of four tubes containing monkey kidney (MK) cells, two tubes are expected to become infected and two tubes are expected to remain free of infection.

TCID₅₀値をもとに、どの程度プラークが形成されるか、おおよその推測することは可能ですか?

プラーク形成を抑制する手順をしない限り、同系統の細胞株を使用いただければ、その細胞に対してウィルスはプラークを形成するでしょう。また、1mlのウィルス保存液に対し、TCID₅₀として表されるプラーク形成単位（PFUs）である数の半数量が期待されるでしょう。これは推定値でなく理論的な根拠に基きますが、試験細胞の50%に感染する希釈限界に基づいて計算された想定値であり、感染初期における感染細胞群においてシングルプラークを産生することが期待される数値であります。場合によっては、2つ以上のプラー具が偶然に形成されるかもしれません。そしてこのように、PFUsの実際の数は実験時に測定されなければなりません。

TCID₅₀が陰性の試験管ではプラークの形成が0で、陽性の試験管では１つ以上のプラーク形成が見られることから、数学的にはプラーク形成値（PFUs）はTCID₅₀値の半分以上になると言えます。より詳細な推定値を求めたい場合、ポアソン分布を適用します。

P(0)：陰性試験管となった割合、m: 容量に対する感染単位の平均値(PFUs/ml)、 P(o) = e(-m)

TCID₅₀で表現されるどんな力価でも、P(o)=0.5 であり、これにより　e(-m) = 0.5 となる。　そして、m = -ln 0.5 つまり　～0.7　であるといえる。

このことから、PFU/mlの平均数を予測するために、TCID₅₀力価（mlに対する）に0.7を乗算することで算出することが可能です。このような計算方法が有効となるのは、TCID₅₀値を採用して感染ウィルスの発現を算出した際の条件と比較し、プラークを可視化するためプロトコールに変更を加えることが発現に影響を与えていないという前提です。

このような推測作業により、1x 10⁵ TCID₅₀/ml(TCID₅₀)　は、0.7×10⁵PFU/mlであると見積もることが可能となります。

Is it possible to determine from the TCID₅₀ how many plaque forming units to expect?

Assuming that the same cell system is used, that the virus forms plaques on those cells, and that no procedures are added which would inhibit plaque formation, 1 ml of virus stock would be expected to have about half of the number of plaque forming units (PFUs) as TCID₅₀. This is only an estimate but is based on the rationale that the limiting dilution which would infect 50% of the cell layers challenged would often be expected to initially produce a single plaque in the cell layers which become infected. In some instances, two or more plaques might by chance form, and thus the actual number of PFUs should be determined experimentally.

Mathematically, the expected PFUs would be somewhat greater than one-half the TCID₅₀, since the negative tubes in the TCID₅₀ represent zero plaque forming units and the positive tubes each represent one or more plaque forming units. A more precise estimate is obtained by applying the Poisson distribution.
Where P(o) is the proportion of negative tubes and m is the mean number of infectious units per volume (PFU/ml), P(o) = e(-m). For any titer expressed as a TCID₅₀, P(o) = 0.5. Thus e(-m) = 0.5 and m = -ln 0.5 which is ~ 0.7.

Therefore, one could multiply the TCID₅₀ titer (per ml) by 0.7 to predict the mean number of PFU/ml. When actually applying such calculations, remember the calculated mean will only be valid if the changes in protocol required to visualize plaques do not alter the expression of infectious virus as compared with expression under conditions employed for TCID₅₀.

Thus as a working estimate, one can assume material with a TCID₅₀ of 1x 10⁵ TCID₅₀/ml will produce 0.7 x 10⁵ PFUs/ml.

ATCCでは、全てのウィルス株に対してプロダクトシートを提供しているのですか?

ウィルスコレクションであるすべてのウィルス株、リケッチア、クラミジア、に対してプロダクトシートが提供されています。もしプロダクトシートが商品に添付されていなかった場合には、住商ファーマインターナショナル（株）生物資源グループ：（Tel:03-5220-1540,Fax:03-5220-1541）にご連絡ください。その際、御購入者のお客様名、及び商品のカタログ番号、商品のバイアルに記載されているその他情報があれば、あわせてご教示ください。

Does ATCC provide a product sheet for every virus?

Product sheets are available for all viruses, rickettsiae, and chlamydiae in ATCC's Virology Collection. Contact our technical service department at (703) 365-2700 or (800) 638-6597 (toll free in USA and Canada) if you did not receive a product sheet. Please have the catalog number, order reference number, and the information from the vial label available.

ATCCウィルスを株実験で使う際に、実験スペースの消毒はどの様に行ったら良いですか?

ATCCでは、常時実験スペースを清潔に保つため、70%の変性エタノールを使用しています。10%希釈した家庭用の塩素系漂白剤や、研究資源材料を消毒するために適切である他の滅菌溶液でも使用できるものがございます。各研究室の必要に応じて、各種の科学的な試験研究おいて必要とされる滅菌対策はすべて講じておくべきです。現在進行中の研究において培養に手慣れた人であっても、そうでない人でも、培養スペースに侵入する人はすべて、このような対策を講じるべき人として含まれます。

How should I disinfect my work area when working with viral cultures from ATCC?

ATCC routinely uses a 70% solution of denatured ethanol for keeping the work area clean. When appropriate, a 10% dilution of household chlorine bleach, or other agent suitable to disinfect the material being investigated, may be used. For the particular needs of the individual laboratory, consideration should be given to all disinfection practices with respect to the scientific activities being performed. This includes any personnel that have access to culture areas who may or may not be familiar with the current work in progress.

ウィルス溶液をこぼしてしまった場合には、どうしたら良いですか?

ATCCでは、流出事故の際の清掃手順に関し、各研究室ごとにそれぞれに有害物質の可能性があるものを扱う際の手順を策定して保有しておくべきであると提言いたします。この種の標準化手順において、考慮されるべき点は、1）扱われた有害物質について　2）操作中に使用された培養物の量　3）研究室自体の大きさと影響を与えるであろう範囲です。また、ベンチ-トップもしくは放棄可能な容器であろうとも、液体の殺菌剤と伝染性の有害物質を混ぜ合わせることが、必ずしも適用できるという科学根拠はありません。ATCCでは、固体物や有害物質を含んでいる可能性のある材料について、一般的に利用されている殺菌剤の使用で、どの程度効率的に滅菌させることが出来るか等の試験は一切行っておりません。また、もしウィルスが希釈されていて液体状となっている場合、殺菌剤に記載されている指示方法では滅菌できない可能性もあります。ATCCでは、現在、除去した流出物も含め、すべての廃棄物についてオートクレーブ滅菌してから廃棄処理を行っています。しかしながら、オートクレーブの代替法としては、例えば、廃棄物の汚染除去には焼却が適切でしょう。

ウィルスを扱う研究室において滅菌剤を選択される場合には、ほとんどの殺菌剤は人に対する病原性が有る有害物質（ヘルペスウィルスや、インフルエンザ、ロタウィルスなどを含む）に対して試験確認を実施しているということに留意してください。環境保護庁では、滅菌剤の製造元が要求事項を作るように指令しています。この様なものとして、パラメーターのヒット、試験標準規格がそれぞれの物質ごとに適用されます。試験方法の基準に関する更なる情報については、EPAへ直接お問い合わせいただくか、下記サイトよりご参照ください。http://www.epa.gov/

あなたの研究室で標準の操作手順を決める際に有効な滅菌剤の決断に役立つ情報は、下記の機関で提供しています。

• 米国疾病管理予防センター
• 米国国立衛生研究所- 安全性部
• 米国農務省　国立動物疾病センター
• 労働省　職業安全衛生管理局
• 米国国立労働安全衛生研究所
• 米国感染制御疫学専門家協会

How should I handle a spilled viral culture?

As part of a spill clean-up protocol, ATCC recommends that each laboratory have their own procedures set in place for handling potentially hazardous agents. This type of standard operating procedure should consider: 1) The agent(s) being handled; 2) The quantity of cultures being manipulated; and, 3) The size and scope of the laboratory itself. It should also be noted that the mixing of liquid disinfectants with infectious materials, either on the bench-top or in a discard receptacle, is NOT a defined science. ATCC does not perform studies to predict the kill rate of material that may contain solids or trapped material within the disinfectant being utilized. Furthermore, if virus has been diluted, and is in liquid form, it may not mix in a predictable manner with the disinfectant of choice. ATCC currently autoclaves all discards from laboratory activities including any spilled material that has been cleared. However, other alternatives to autoclaving, such as incineration, may also be suitable for thorough decontamination of waste materials.

When choosing a disinfectant to use in a virology laboratory, keep in mind that most viral disinfectants are tested using standards that include human pathogens such as herpes virus, influenza, and rotavirus. The EPA mandates claims made by manufacturers for their disinfectants. As such, a set of parameters and standards for testing are applied to each proposed material. For additional information pertaining to testing regulations, please contact the EPA or see the Web site at http://www.epa.gov/

The following organizations are also available to help you make disinfection decisions for your laboratory's standard operating procedures:

• Centers for Disease Control and Prevention
• National Institutes of Health - Division of Safety
• National Animal Disease Center
• Occupational Safety and Health Administration
• National Institute for Occupational Health and Safety
• Association for Professionals in Infection Control and Epidemiology, Inc.
  
  

凍結乾燥品の状態でウィルスをオートクレーブした場合には、ウィルスを完全に死滅させることができますか?

いいえ、できません。凍結乾燥された状態のウィルスを滅菌する場合には、オートクレーブの前に、まずバイアルを開封して水分を含ませて膨潤させてください。バイアルの内容物に湿度が無いと、バイアルに含まれる微生物を十分滅菌するだけの温度まで高くならないでしょう。

Will autoclaving completely kill a virus that is in the freeze-dried form?

No. To destroy organisms that are in freeze-dried form, open the cryopreservation vial and add moisture to the contents prior to autoclaving. Without moisture, the contents of the vial will not reach a high enough temperature to destroy the enclosed culture.

私の保有しているウィルス株が、マイコプラズマに汚染されてしまいました。何か、救済措置はありませんか?

マイコプラズマによって汚染されたウィルスについては廃棄されることをATCCでは推奨いたします。しかしながら、ウィルスが1つしかないものであれば、汚染物質の除去を試みても良いかもしれません。マイコプラズマをウィルスから除去してくれるB-M Cyclin （ロッシュ社型番：799050）などの市販薬が入手可能です。

My viral culture has been contaminated with mycoplasma. Can it be saved?

ATCC recommends that viral cultures contaminated with mycoplasma be destroyed. However, if the virus is unique, the user may attempt to cure the contamination. Reagents are available commercially for clearing mycoplasma contamination from some types of viral cultures, such as B-M Cyclin from Roche (Roche Catalog No. 799050).

MOI(Multiplicity of Infection)とは何ですか?

MOI とは、 "Multiplicity of Infection（感染多重度）を意味します。感染を受ける細胞に対する感染性ウィルスの比率を表しています。推奨のMOI は、0.1（各10細胞に対しウィルス粒子1つを培養した値）～0.01 です。MOI一般的な概念としては、培養液中で感染性ウィルス1粒子から存在する宿主細胞全てに対して導入されます。しかし、同じ細胞に対していくつものウィルスが感染することにより、感染率に変化がないということもあります。このような現象を減らすために、すべての細胞に対して感染するような高いMOI値で感染させるようにしてください。

What is MOI?

MOI stands for "Multiplicity of Infection." It is the ratio of infectious virus particles to the number of cells being infected. The recommended MOI is in the range of 0.1 (meaning that you inoculate 1 virus particle for every 10 cells) to 0.01. The general theory behind MOI is to introduce one infectious virus particle to every host cell that is present in the culture. However, more than one virus may infect the same cell which leaves a percentage of cells uninfected. This occurrence can be reduced by using a higher MOI to ensure that every cell is infected.

ウィルス株のIFU(Inclusion Forming Units)を決定したいのですが、その方法を教えてください。

1バイアル中のウィルスに対するIFU(Inclusion Forming Units)値を決めるためには、まずはATCCの凍結保存株から培養を始めることが必要です。タイトレーションは、それから1つの封入体を生じるために必要なウィルスの容量を定量化するために行われます。1つの封入体とIFUは、同じ意味になります。

How do I determine the IFU for my viral culture?

To determine the IFUs, or Inclusion Forming Units, of a viral preparation, the material will first need to be cultured from the ATCC cryopreserved stock. A titration can then be performed to quantify the amount of viral material required to produce one inclusion body. One inclusion body is the equivalent of an IFU.

ATCCでは、ChlamydiaのTCID値はどのように決定していますか?

ATCCではクラミジア培養液の感染力価は、調整毎の感染数単位で表すのではなく、免疫蛍光染色法により決定しています。力価は一定期間一定の希釈率で培養したうえで、11mmの丸いガラスカバーにつき少なくとも5つの封入体を検出するように報告しています。しかしながら、この手順では、実験のエンドポイントを検出することはできません。クラミジアのTCID値は希釈されて調整されたそれぞれの試験管を単純比較しただけの値です。このような理由から、ATCC株におけるクラミジアの力価は、感染後のエンドポイントであるTCID[50]（細胞50%に対する感染力）で表すのではなく、TCID（細胞を感染させるための投与量）として報告しています。

How does ATCC determine the TCID for Chlamydia?

ATCC determines the infectious titer of Chlamydia cultures by the detection of inclusion bodies by immunofluorescence rather than the number of infectious units per preparation. The titer is reported as the detection of at least five inclusions per 11-mm round coverslip at the specified dilution and length of incubation. However, this procedure does not detect the endpoint of the infection. The TCID for Chlamydia is only a titer comparison from one tube at each dilution. For this reason, ATCC reports Chlamydia titers as TCID (tissue culture infectious dose) and not TCID[50] (50% tissue culture infectious dose) which reports the endpoint of the infection.

ATCCにウィルス株を寄託するためにはどうしたら良いですか?

ATCCに寄託いただくためのご質問方法は、下記サイトのMake a Depositをご参照ください。　

How do I deposit a culture with ATCC?

See our Make a Deposit to inquire about depositing materials at ATCC.