バクテリア株編

嫌気性条件で培養するためのコツはありませんか?

嫌気チャンバー内、もしくは嫌気ガスが試験管へ吹きかけられるカニュラシステム下の環境で株を移植してください。嫌気培養には以下のいずれかの手法で対応が可能です。嫌気チャンバー内で試験管のスクリューキャップをゆるめて培養するか、嫌気ガスパックジャーの中に試験管を入れてスクリューキャップを緩めて培養するか、もしくは試験管上部の気層が嫌気ガスで満たされるようにステリルブチル性のゴム栓をして培養をすることで嫌気培養が可能です。

What do you recommend for achieving anaerobic conditions for cultures?

Transfer cultures under anaerobic conditions by either of the following: Use of an anaerobic gas chamber, or placement of test tubes under a gassing cannula system hooked to anaerobic gas. Anaerobic conditions for incubation may be obtained by any of the following: Loose screw-caps on test tubes in anaerobic chamber, loose screw-caps on test tubes in an activated anaerobic Gas Pak jar, or use of sterile butyl rubber stoppers on test tubes so that an anaerobic gas headspace is retained.

バクテリオファージを培養するための手順を教えて下さい。

液体窒素から出して融解したファージもしくは凍結乾燥状態のファージを回復させるための手段

・ファージが保存されているバイアルを開封する前に、宿主として推奨されている菌株用の専用培地を用意してください。その培地で18-24h宿主菌株を培養し、ファージの宿主として使用する様にしてください。

・凍結保存されているファージは、無菌状態で1mlの推奨培地で膨潤して良く懸濁してください。もしファージが溶解されてフィルタ－で透過されたのであれば、0.5mlの培地を加えて1mlになるよう調整してください。推奨培地で作成した寒天プレート状の培地をインキュベーター内でプレインキュベーションしておいてください。終濃度0.5%濃度の寒天を溶解した培地2.5mlに対し、18-24h培養しておいた宿主菌を2-3滴加え混ぜ、予めプレインキュベートしておいた寒天培地に覆うように回しかけてください。上掛けするソフトアガー溶液の温度は43-45℃となるように維持してください。ウォーターバスインキュベーターを使用して保温することも良いと思われます。上掛けしたソフトアガーが固まるまでしばらく静置しておいてください。

・膨潤したファージ溶液は、オリジナルの原液を0.1mlとりわけて0.9mlの培地を加えて混ぜるという手順で、段階希釈してください。指示された希釈回数分、繰り返し段階希釈をしてください。

・各希釈液から、一滴づつソフトアガープレートの表面上に落して、渇くまで静置してください。3-4回ほど希釈したファージ希釈液であれば、プレートに播く濃度としては適切でしょう。一晩培養し、大腸菌が溶菌されているかどうか確認してください。高倍率で希釈されたファージ溶液を滴下したプレートでは、個々のプラークを確認することが出来て、カウントすることも可能でしょう。ほとんどのファージ株がソフトアガーを使用せずにファージ力価を測定することが可能でしょう。寒天培地に1mlの宿主菌溶液を乗せてプレート全面が宿主溶液で覆われるように傾けながら塗り拡げた後、余分な菌溶液を吸い上げ除いてください。プレート表面が乾いたら、各希釈率のファージ溶液を先程と同様に滴下してください。

注意：寒天プレートにファージを滴下することで溶菌しているか判断が容易に可能となります。もしファージを寒天プレートに広げる前に、ソフトアガー溶液に予め加えた場合には、霞んだ小さいぷラークを見つけることが難しくなります。宿主菌がファージ耐性菌である場合、プラークの形態は覆い隠されてしまうことがあります。

ファージの増幅方法
・上記で記載されたとおり宿主菌を加えたソフトアガーを寒天培地に覆い掛けた寒天培地を準備し、その表面に濃縮したファージ約0.5mlを添加して覆うように播き広げて培養してください。他の代替手法としては、宿主菌を加えたソフトアガー溶液に直接ファージ溶液を加えてから寒天プレート上に広げ、固まるまで静置してから培養してください。大容量で調整する場合には、サイズの大きなT-フラスコを使用し、適切な寒天培地の上に、宿主菌を加えたソフトアガー約12mlを上掛けして使用することも可能です。この場合、ファージは固まった表面上に覆う様に回しかけてください。もしくは、前述したとおり宿主菌を加えたソフトアガーにファージを直接加えていただくことも可能です。

・24時間ほど培養したら、表面のソフトアガーを掻き取って回収してください。1,000rpmで25分間遠心し、宿主菌の残渣と寒天を沈殿させ、上清のみを回収してください。

この上清を0.22umサイズのフィルタ－で濾過し、濾過されたファージ溶液は4-8℃で保存してください。そのファージ溶液は冷蔵保存で長期保存が可能です。凍結する場合、凍結保存剤を添加する必要はありません。液体窒素タンクをお持ちであれば、液体窒素の気層中で保存していただくことが長期保存の方法として最適です。ほとんどのファージは凍結乾燥することが出来ます。ATCCでは、濾過したファージ溶液と等量の20%スキムミルクを混ぜてから凍結乾燥しています。

What is the procedure for propagating bacteriophages?

To recover phage from a freeze-dried or thawed liquid nitrogen vial:

・Prepare an actively growing broth culture of the recommended host strain before opening the phage specimen. The host should be 18 to 24 h old.
・Aseptically rehydrate the freeze-dried phage specimen with 1 ml of the recommended broth medium. Mix well. If phage is a thawed filtrate, add approximately 0.5 ml of the broth to bring volume up to 1 ml. Pre-warm plates of the recommended medium in an incubator. Overlay the surface with 2.5 ml of melted 0.5% agar (same medium) which contains one or two drops of the 18 to 24 h host bacterium. Maintain the temperature of the melted soft-agar at 43^oC to 45^oC. It may be advisable to use a water bath. Allow overlay to harden.

・The rehydrated phage can be serially diluted by passing 0.1 ml of the phage into a tube containing 0.9 ml of the broth medium. Repeat for as many passages as desired.

・One drop of each dilution is spotted on the surface of the prepared plates. Allow to dry. Three to four dilutions can be placed on each plate. After overnight incubation, lysis should be visible. At the higher dilutions, individual plaques should be countable. Many strains may also be titered without a soft-agar overlay. Pipette approximately 1 ml of the host onto the surface of each plate. After tilting the plate to ensure the entire surface is covered, the excess liquid is aspirated off. After the surface dries, the various dilutions of the phage are dropped onto the surface as before.

Note: Spotting the phage on plates makes visualizing the lysis easier. If phage is added directly to soft-agar before pouring plates, hazy or tiny plaques may be difficult to see. Resistant host bacteria may also mask plaque formation.

To propagate phage:

Prepare plates with the soft-agar/host overlay as above and covering the surface with approximately 0.5 ml of the concentrated phage. Or, alternatively, you may add the phage directly to the melted agar/host before pouring over the plates. For larger amounts, large size T-flasks can be prepared with the recommended agar, and approximately 12 ml of melted soft-agar/host poured over the surface. Phage is then allowed to run over the hardened surface. Phage may also be added directly to melted soft-agar before pouring as described above.

・After 24 h of incubation, the soft agar is scraped off the surface of the agar plates. Centrifuge at about 1,000 rpm for 25 min to sediment the cellular debris and agar. Conserve the supernatant.

This supernatant is passed through a 0.22 μm filter and the filtrate is stored at 4^oC to 8^oC. Lysates should remain viable under refrigeration for long periods. They may also be frozen with or without cryoprotectant. If available, liquid nitrogen storage is the best method for long-term storage. Most phage can also be freeze-dried. We use 20% skim milk mixed half and half with the filtrate.

Acholeplasma, Mycoplasma, Ureaplasma, Spiroplasma, and Entomoplasmaなどの真正細菌はどのように培養したらよいですか?

増幅培養方法：

1. ATCCが指定する培地を用いてください。滅菌された試験管へ2mlの液体培地を移し入れ、また他の試験管にも4.5mlの液体培地を入れておいてください。
2. 指示に従って菌のバイアルを開封してください。
3. 1ml用のパスツールピペット、もしくは一般的なピペットを使用して、2mlの培地から0.5-1mlを取り、菌株のペレットを膨潤してください。
4. その膨潤溶液を無菌的に元の培地が入っていた試験管に戻し入れてから良く懸濁してください。
5. 段階希釈をするため、菌の懸濁液0.5mlを取り分けて、さきほどの4.5mlの培地が入った試験管へ無菌的に移してよく懸濁してください。同様に、2本目の懸濁液を含む試験管から0.5mlを取り分け、3本目の培地を含む試験管へ懸濁、というように段階希釈をしてください。力価を測定するためだけでなく、様々な生育段階における変化を維持調整するためにも、段階希釈をすることは重要です。多くの菌株は、酸性、アルカリ性の条件になると急激に死滅してしまいます。菌株のバイアル中には、凍結乾燥の際に使用された凍結保存剤が含まれており生育を抑制する場合があり、それを避けるためにも菌液を段階希釈して調整することが推奨されます。
6. コントロールとして、植菌しない培地も準備し培養して下さい。
7. プレート寒天培地をコロニー形態を確認するために使用してください。段階希釈して調整した菌の希釈液を、4枚もしくはそれ以上の寒天培地プレート上に滴下することで、コロニー数：CFU(colony-forming units)を測定することも可能です。しかしながら、すべての菌株において寒天培地上で同様に培養できるわけではありません。
8. 適温かつ適切な条件下で試験管菌液、および寒天プレートを培養してください。生育のために要する時間は菌株により大きく異なります。寒天培地上での一般的な生育には更なる培養時間が必要となります。
9. 使用される液体培地にもよりますが、生育しているかどうかは濁度や色の変化、その2つの視覚的変化で認識することができます。もし指示にある場合には、嫌気性条件下で培養しなければならない菌株もあります。嫌気ジャーを使用するなど、他の手法でも適切な条件となるよう御利用ください。

注意：冷凍温度で使用するまで保存する場合には冷凍しておいてください。

ATCCでは、指示液入りの培地を使用して培養する菌株に対しては、二酸化炭素条件下で培養することが可能であるとわかっています。CO₂インキュベーターは、培地の色を変えてしまうほどpHを下げる可能性があります。培地に少し濁度が出ていたとしても、この培地の変化により生育の確認が難しくなってしまうでしょう。

What is the procedure for propagating mollicutes such as Acholeplasma, Mycoplasma, Ureaplasma, Spiroplasma, and Entomoplasma species?

For propagation:

1. Using the medium suggested for the strain, pipette 2 ml of broth into a sterile tube. Prepare additional tubes to contain 4.5 ml of the broth in each.
2. Open the vial according to the instructions.
3. Using a Pasteur or 1 ml pipette, withdraw approximately 0.5 to 1 ml from the tube containing 2.0 ml. Rehydrate the pellet.
4. Aseptically transfer this aliquot back into the tube. Mix well.
5. Make serial dilutions by transferring 0.5 ml from the original tube to a tube containing 4.5 ml. Repeat process by transferring 0.5 ml from the second to a third tube, etc. Dilutions are important, not only for titration purposes, but also to keep culture in varying stages of growth. Many strains will die out rapidly once acid or alkaline conditions are reached. It is recommended to prepare several dilutions from the initial tube as the cryoprotectant used in the freeze-drying process often inhibits growth.
6. Use an uninoculated tube of broth to serve as a control.
7. Plates may be inoculated to check colonial morphology. You can also spot each dilution on the surface of the plate (4 or more/plate) to determine the number of colony-forming units. However, not all strains do well on solid medium.
8. Incubate all tubes and plates under the recommended conditions and appropriate temperature. The time necessary for growth will vary from strain to strain. Growth on plates generally requires additional incubation.
9. Depending on the medium used, growth will be indicated by increased turbidity, a color change, or both. If designated, you MUST follow anaerobic conditions. Use an anaerobe jar or other appropriate procedure.

Note: Store vials at freezer temperatures until ready to use.

We have found that using a "candle jar" for CO₂ conditions works better for those strains whose medium has an indicator present. CO₂ incubators may lower the pH of the medium enough to cause a color change. This change may make it difficult to observe growth with those strains that show little turbidity.

バクテリア株は実験に使用するためにどのくらいの頻度で継代したら良いですか?

継代までの間、4℃で保存しておいたスラント培養された生育菌株を繰り返し使用することは、コンタミネーションや突然変異を誘発することにつながります。生化学的マーカーや耐性パターンや感受性などの性質の変異に関する頻度や、特徴は株によって幅広く異なります。

How often should I subculture a bacterial strain in order to have it available for subsequent experiments?

Repeated transfer of bacterial cultures on slants with storage at 4^oC between transfers can lead to contamination and spontaneous mutation. The rate and character of the mutation (biochemical markers, sensitivity and resistance patterns) will vary with each strain.

全てのATCC微生物株に関して、1vial中に存在する総菌数はわかりますか?

Preceptrol®商品、バクテリオファージ、マイコプラズマ、Ureaplasma sp.以外、の商品では、菌数をご案内することができません。しかしながら、ATCCではすべての菌株において、10(4)cfu/vial 以上となる生育能力を有する菌株として品質確認を行っています。

Are total cell counts available for all ATCC cultures?

No, total cell counts are only available for strains designated as Preceptrol® cultures, bacteriophages, and Mycoplasma and Ureaplasma sp. We do however, perform a viability check on all strains to ensure a minimum of 10(4) cfu/vial.

2層の培養条件は、どのように調整したらよいですか?

二層の培養条件を必要とする菌株の培養には、スラント寒天培地もしくはプレート寒天培地に加え、推薦の液体培地が必要となります。菌株の入ったバイアルを開封し、液体培地で十分に懸濁したら、そこから0.3～0.5mlの懸濁液を取り分けて、スラント寒天培地上へ加え重ねて培養します。寒天プレートを使用する場合には5mlの菌懸濁液を加え重ねて培養してください。

How do you achieve a biphasic growth environment?

In cultures that require biphasic conditions, an agar slant or plate and a tube of the recommended broth media are needed. The culture is opened and transferred into the broth, and then 0.3 to 0.5 ml of this broth is used to overlay the agar slant. If using an agar plate, 5 ml of the broth should be used as an overlay.

オリジナルのアンプルから継代した場合、何回までが適切な回数ですか?

ATCCでは、ATCC Genuine Culture® を使用して移植、継代される場合には、5回以上繰り返さないようにしてください。繰り返しの継代作業や長期培養により、コンタミネーションのリスクが増したり、遺伝的もしくは形態的変異などの望ましくない結果を導く可能性があります。ひとつのご提案としては、ATCCからATCC純正の菌株を受け取ったらすぐに、将来ご自身で使用されるのための専用のシードストックとして、凍結保存バイアルを作成しておくことを推奨いたします。医療分野から製薬、また生物医薬品の産業分野の幅広い分野において、継代数を5継代もしくはそれ以下に抑えることが推奨されています。

著書：U.S. Pharmacopeia
該当箇所：Chapter 51: Antimicrobial Effectiveness Testing.

2005年の米国薬局方フォーラムでは、ATCCのオリジナル株から5継代を超えた生育菌株を試験用に使用してはならないとのコメントがありました。

更なる情報は、ATCC Technical Bulletin No. 6をご参照ください。

How many times can I passage my culture?

We recommend no more than 5 transfers or passages be made from an ATCC Genuine Culture®. Repeated passage or serial culture increases the risk of contamination and can result in undesirable genotypic and/or phenotypic changes. One suggestion is upon receipt of the ATCC Genuine Culture to make your own frozen seed stock that can be used for future work. The recommendation of five passages or fewer from the ATCC reference culture is broadly accepted in the healthcare community and the pharmaceutical and biopharmaceutical industries.

U.S. Pharmacopeia Chapter 51: Antimicrobial Effectiveness Testing. U.S. Pharmacopeia National Formulary, 2005 states:

"The viable microorganisms used in the test must not be more than five passages removed from the original ATCC stock."ATCC agrees with this recommendation. For further information see ATCC Technical Bulletin No. 6.

カタログに記載されている培地以外に代替培地を使用しても良いですか?

ほとんどのケースにおいて、菌株は各種幅広い培地で生育するでしょう。ATCCが微生物を培養するために使用している培地は、寄託者の方から指定された培地です。引き続き、遺伝子型や形態的な特徴を維持しつづけるために、ATCCでは寄託者からの指示のある培地を使用していく予定です。もし他の培地をご利用される場合には、指定培地と同時にご希望の培地で培養可能かどうかお試しいただくことを推奨します。代替品の保証対象についての注意点としては、カタログに記載されている培養手順すべてに従って御利用いただいた場合にのみ、保証対象となりえることを予めご承知ください。

Can another media be substituted for the one recommended in the catalog?

In many cases the bacteria will grow on a variety of media. The media we use to propagate the organism is what the depositor has specified. We continue to use the depositor's recommended media to ensure that all of the genotypic and phenotypic characteristics of the strain have been maintained. If an alternate media is desired, we recommend growing the culture on both the specified media and the substitute simultaneously. It should be noted that replacement cultures can only be obtained if all propagation procedures stated in the catalog were followed.

カタログの記載に「Preceptrols® 」と記載がありますが、どういう意味ですか?

Preceptrol® 商品は、ATCC菌株のうち、ある一定の価格が設定されている商品です。Preceptrol® 商品は、人気株から収集されている菌株であり、最もお求めやすい価格設定の商品となっています。出荷形態は血清バイアルで、二重ガラスバイアルの代わりに、ゴム栓で密封されています。品質管理試験については、他の商品と同様に確認されております。また、使用期限についてはバイアルラベルに記載がございますのでご確認ください。この商品は、教育目的でご使用いただくためには最適な商品となっています。ほとんどの商品が、各菌の基準株（Type Strain）となっています。

What does it mean when cultures are listed as Preceptrol® in the catalog?

Preceptrol® is one of the pricing codes for our bacteria. The organisms designated as Preceptrols tend to be our more popular sellers and are also the least expensive to purchase. They are distributed in serum vials capped with butyl rubber stoppers rather than the double-sealed glass vials. The same level of quality control is performed on these cultures and the shelf life is that specified on the label. These cultures are good for use as teaching strains. In some cases, they are the type strains of the species.

ATCC株を起眠する際、起眠できず不生育となってしまう要因にはどのようなものがありますか?

・バイアルに含まれる菌を全て使用しなかった。
・カタログで推奨されている培地を使用しなかった。
・推奨温度で十分な時間培養されていない。
・バイアルから取り分けた菌を、直接大容量の培地へ植菌して培養してしまった。

What are some of the common causes for failing to revive ATCC cultures?

・The entire content of the vial was not used as the starting inoculum.
・The medium specified in the catalog was not used.
・There was insufficient incubation time at the recommended temperature.
・An attempt was made to grow too large a quantity directly from the vial.

Type Strain(基準株)とは何ですか?

Bacteriological Code of 1990によると、最新の命名法においては新しい分類群が論文などで提案される場合、著者は新しい属または種を記載し命名基準の特性を出版物に明示しなければならないとのことです。このように、「基準株」とは命名基準となるタイプから系統を引きついだ生育能力のある株から成ります。Judicial Commission of August 1999によると、生育能力のある基準株は、少なくとも2つの永久的に確立されている資源保存機関において預けられていなければならないとのコメントがありました。

What is a type strain?

According to the Bacteriological Code of 1990, when a new taxon is proposed the author must designate a specific strain to be the nomenclatural type in the publication describing the new genus or species. Thus the type strain is composed of viable cells which are descended from the nomenclatural type. The Judicial Commission of August 1999 stated that a viable culture of a type strain must be deposited in at least two permanently established culture collections.

種特異的ではない菌株にも「Type Strain」はあるのですか?

非常に多くの樹立株が研究されているので、稀にもともとの基準株となったタイプには、その種の大多数の株が有するにも関わらず、その重要な特性が失われていることが判明する場合もあります。凍結保存方法が確立される以前に、いくつかの株では継代により重要な性質が失われたという株もあります。この一例が、ATCC 15313 Listeria monocytogenesであり、溶血性を失った株であるため、論文(1983) Int. J. Syst. Bact. 33:429)において、L. monocytogenes.の基準株の代りとしてNCTC 7973 (ATCC 35152)を登録すべきであると諮問委員会へ提案されました。しかしながら、諮問委員会では、論文：[(1986) Int. J. Syst. Bact. 36:357-358; (1987) Int. J. Bacteriol. 37:85-87]により、この提案を棄却としています。

Are there type strains that are not typical for the species?

Sometimes after a greater number of isolates are studied, it is found that the original type does not possess all significant characters of the majority of the strains in a species. Before cryopreservation was common practice, some strains lost key characters through repeated subculture. An example of this is ATCC 15313 Listeria monocytogenes. Because the strain is no longer hemolytic, a proposal [(1983) Int. J. Syst. Bact. 33:429) was made to the Judicial Commission to replace it with NCTC 7973 (ATCC 35152) as the type strain of L. monocytogenes. However, the proposal was rejected by the Judicial Commission [(1986) Int. J. Syst. Bact. 36:357-358; (1987) Int. J. Bacteriol. 37:85-87].

バクテリア菌株の保存方法に関して、お薦めの方法はありませんか?

液体窒素の温度で保存することがATCC微生物株を保存する方法として一番良い方法であることが判明しています（1960年から保存されている株の99%以上が生育しています）。10%グリセロール、もしくは5%DMSOを培養用培地（適切な特徴を保持させるため）に加えた凍結保存培地で静止した段階の微生物を凍結します。

液体窒素（LN）に漬け込むことで、もしくはプログラム凍結法（-1^oC/minで-40℃まで下げてから）が適切である微生物も存在しますが、ほとんどの株が液体窒素タンクの気相中で凍結保存することが可能です。

What is the best method of preserving bacterial cultures?

Storage at liquid nitrogen temperatures has been found to be the best method of maintaining ATCC bacterial strains for extended periods (over 99% have survived, many since 1960). Early stationary phase cells are frozen in maintenance broth (one that will insure retention of desired traits) with 10% glycerol or 5% DMSO. Many will survive freezing by plunging into liquid nitrogen (LN), others prefer a programmed freeze of -1^oC/min to -40^oC and storage in LN vapor phase in the tank.

もし液体窒素が入手できない場合には、どうしたらよいですか?

凍結保存用の凍結用剤：20%スキムミルクや12% シュークロス、10%血清等、適切な保存溶液を加えてからフレームシールガラスバイアル中で凍結乾燥した菌株は、4℃もしくはそれ以下の温度で保存することが可能です。-50℃もしくはそれ以下の温度の冷凍庫でも保存が可能です。菌株の調整は、上記の液体窒素タンクでの保存方法と同様に行ってください。菌株の起眠率は保存温度が上がるに従って低減します。起眠時には37℃のウォーターバースで迅速に溶解し、全量を新しい培地に加えて適切な培養条件で培養してください。一度溶解した菌液は再凍結しないでください。

If liquid nitrogen facilities are unavailable, what alternative methods are available for storing bacteria?

Freeze-drying with a cryoprotectant such as 20% skim milk, 12% sucrose or 10% serum in a flame-sealed vial, stored at 4^oC or below is one. Freezer temperatures of -50^oC or below may be used also. Prepare cells similar to that described above for LN storage. Cell viability is increased as the storage temperature is decreased. Revive by rapid thaw in a 37^oC water bath, inoculate all contents into fresh medium and incubate under appropriate conditions. Do not refreeze.

ATCCではバクテリアの凍結方法や凍結乾燥方法として、どのような方法で行っていますか?

凍結保存方法について：

1.選択培地の最適状況下で、対数増殖期の後半、もしくは初期の増殖停止状態に至るまで、菌株を培養してください。

2.液体培地を用いた場合には、遠心して上清を除去し、菌体を回収してください。

3.少量の同じ培地に懸濁し、等量の20%グリセロール(vol/vol)を加えて良く懸濁してください。

4.スラント寒天培地上で生育した菌株は、適切な培地で成育菌株を洗い落とし、20%のグリセロールを等量加えてください。

5.プラスチック製の小さいバイアルに分注し、凍結してください。低温であればあるほど長期保存が可能です。液体窒素での保存が理想的です。

凍結乾燥方法について：

上記と同様に菌株を回収ていただきますが、凍結乾燥に使用する機器に依存し、色々な凍結保存用剤を使用していただきます。ATCCで通常よく使用されている二重バイアルの簡単なチャンバーの場合には、20% (wt./vol.)のスキムミルクを使用します。マニフォールド法の場合には、24%シュークロース溶液を終濃度12%（wt./vol.）となるよう培地で希釈した12%シュークロース溶液を使用します。大型の市販の凍結乾燥器を使用する場合には、ATCCでは凍結試薬18（下記組成参照）を使用しています。

Trypticase Soy Broth, 1.5 g
Sucrose, 10 g
Bovine Serum Albumin Fraction V, 5 g
Distilled water, 100 ml
0.2 μm フィルタ－で滅菌してから使用してください。

菌体の懸濁液を適切なバイアルに分注してから作業をしてください。ATCCで使用しているほとんどのバイアルには、0.2mlの懸濁液が添加されています。Preceptrol strains：プレセプトロール商品の、血清バイアルには、0.5mlの菌液が封入されています。

What methods for freezing and freeze-drying bacteria are used at ATCC?

For freezing:

1. Grow cells to late log or early stationary phase under optimal conditions on the medium of choice.

2. If broth culture is used, centrifuge to harvest the cells. Pour off the supernatant.

3. Resuspend the cells in a smaller volume of the same growth medium, and add an equal amount of 20% (vol/vol) glycerol.

4. If cells were grown on agar slants, wash off the growth with the appropriate broth and add an equal amount of 20% glycerol.

5. Aliquot into small plastic vials and freeze. The lower the temperature, the longer the cells will survive. Liquid nitrogen storage is the most ideal.

For freeze-drying:

Harvest the cells as above, but depending on the freeze-drying system, various cryoprotectants may be used. For a simple chamber double-vial method that we use for most of our strains, 20% (wt./vol.) skim milk is used. For a manifold method, a 24% sucrose solution diluted with growth medium to yield a 12% (wt/vol) sucrose solution (12% final concentration) is used. For a large commercial freeze-dryer, we generally use the cryoprotectant Reagent 18 (described below).

Trypticase Soy Broth, 1.5 g
Sucrose, 10 g
Bovine Serum Albumin Fraction V, 5 g
Distilled water, 100 ml
Filter sterilize through a 0.2 μm filter.

The cell suspension is dispensed into appropriate vials and processed. Most of our vials contain 0.2 ml of suspension. The serum vials used for Preceptrol strains contain 0.5 ml.

ATCCに菌株を寄託するためにはどうしたらよいですか?

微生物のコレクションが特に新規の細菌（ゲノム配列が決定された分離株、真にユニークな特徴を有する環境分離株や人の病原性に関連する臨床分離株）であった場合には、基準株を特定する必要があります。 専門知識のある方にレビューされた論文等で十分に特徴づけされた菌株であることが、我々ATCCのコレクションの重要な要素です。このように、最新のpolyphasicな技術によって特徴づけられる菌株は、特徴づけられていない分離株より好ましい株であるといえます。更なる情報は、Deposit Serviceをご参照ください。

あなたの菌株が提供可能となったら、オンラインフォームに記入してATCCの寄託担当者と連絡をとってください。チェック作業を迅速にすすめるため、菌株の学名や、科学界に対する興味深い点を含めた十分な情報を必ず提供するようにしてください。その後、寄託株について、ATCCの寄託担当者から直接連絡が参ります。

Can I deposit a bacterial culture with ATCC?

The bacteriology collection specifically seeks newly identified type strains, isolates with sequenced genomes, environmental isolates that have truly unique properties and clinical isolates related to emerging issues in human health. Well-characterized cultures supported by peer-reviewed publications are the backbone of our collection. Thus strains characterized by modern polyphasic techniques are preferable to less characterized isolates. For more information, please view our Deposit Service.

When you are ready to submit your culture, complete the online form to contact a collection scientist. Be sure to provide sufficient information to facilitate the review process, including the name of the organism and what would make it of interest to the scientific community. A collection scientist will then contact you to discuss your deposit.

寄託フォームの署名欄には、誰を記載したら良いですか?

寄託フォームは、あなたの株を分譲する権限をATCCに対して与えるための、法的拘束力のある文書です。 寄託フォームの署名者は、寄託者の組織もしくは機関から正式に認められた署名者でなければなりません。 ご所属の機関の技術移転部で、知的財産権を担当し、実際にmaterial transfer agreements（MTA）を担当する方が一般的です。必ずしも研究所や研究プログラムの主任研究員（PI）に、この権限があるとは限りません。各寄託者は、寄託フォームを送る前に、署名権限がだれにあるかを確認しておく必要があります。

Who can sign my deposit form?

The deposit form is a legally binding document that grants the ATCC the authority to distribute your material. A duly authorized signatory from the depositor's institution or organization MUST sign the deposit form. This is typically a member of the technology transfer office that represents the intellectual property rights and completes material transfer agreements (MTAs) for your organization. The principal investigator (PI) of the laboratory and/or research program does not always have this authority. Each depositor should determine who has signing authority for their institution before sending the deposit form.

Certificate of Deposit(寄託確認書)を受けるまでに、どのくらい時間がかかるのでしょうか?

科学雑誌では、その論文に使用された株が既存の保存機関を通じて入手が出来る株であるかどうかを要求する事がよくあります。ATCCでは、ご依頼があれば凍結保存後の品質管理データである純度や起眠率などのデータを正式な書類としてご提供しています。分譲までにかかる時間は菌株により異なりますが、一般的には最初に寄託していただいてから3-6ヶ月ほどのお時間がかかります。ATCCコレクションへご寄託いただく場合には、この所要時間を念頭においてご検討ください。

How long does it take for me to receive a Certificate of Deposit?

Scientific publications often require proof that referenced strains are available through an established culture collection. Upon request, ATCC offers a certificate of deposit after completion of purity and viability tests following preservation. Processing time varies depending on the organism, but this may take 3-6 months from the original deposit date. Please keep this in mind when making future deposits to our collection.

一般的な株(General Collection)としてATCCへ寄託する際にかかる費用はどの程度ですか?

一般分譲株（general collection）としてお預けいただく場合には経費はかかりません。その他、ATCCでは、特許取得された生物株の保管サービス(Patent Deposit Service)の他、cGMP Safe Deposit Service, BioEscrow® Deposit , Contribute to the iPS Cell Repositoryもご提供しています。

What is the cost to deposit in the general collections?

There is no cost for making a deposit to the general collection. ATCC also offers repository services for patented biomaterials and culture safe deposit services for storage of proprietary materials.ATCC also offers repository services for Patent Deposit Service, cGMP Safe Deposit Service, BioEscrow® Deposit, Contribute to the iPS Cell Repository for storage of proprietary materials.

寄託時の株は、どのように送ったら良いですか?

ATCCの寄託担当者から送付許可が出ない限り、寄託予定の株をATCCへ送らないでください。株は生育した状態で試験管内、もしくはプレートやスラント寒天上、もしくは凍結乾燥された保存状態で送付していただくことが可能です。株が生育状態で送付される場合には、試験管のサンプルを2本、もしくは株と一緒に未植菌の寒天培地プレートを送付していただけると大変助かります。また、送付の際には株を培養するための特別な培地組成や、維持条件、などを記載した手順書を同封して送付していただけますようお願いします。海外から株を寄託いただく場合には、凍結状態での送付は通関業務で遅延が発生した場合に溶解してしまう可能性があるため推奨できません。寄託者は、ATCCへ送付する寄託株およびその梱包や株の移動に関して、適用される法令を順守する最終的な責任者となります。

How should I send my culture?

Do not send cultures to ATCC until instructed to do so by a collection scientist.　Cultures may be sent live, in a tube, on a plate or slant, or preserved either freeze-dried, or frozen. If the cultures are sent live, we appreciate receiving two tubes or plates of uninoculated media. Please send along copies of any manuscripts describing the organism or documents that describe specialized conditions for the growth and maintenance of the organism. We do not recommend sending frozen cultures from overseas, since they may thaw if they are delayed in customs. Depositors are ultimately responsible for the shipment of deposits to the ATCC and compliance with all applicable government regulations for the packaging and movement of the material.

商品にATCC MTAのコピーが添付されているのはなぜですか?

研究資源を分譲されたすべての機関では、MTAによるいくらかの恩恵を受けます。最新版のATCC MTA(Material Transfer Agreement) Last updated は、下記サイトからご参照ください。
ATCC MTA (Material Transfer Agreement)

Why do I receive a copy of the ATCC's MTA with my culture?

All parties in the distribution of research materials are afforded some benefit with the MTA. See
ATCC MTA (Material Transfer Agreement) .