原生生物株編

ATCCへ原生動物を寄託するには、どうしたらよいですか?

ご質問等は、ATCCウエブサイトのMake a Deposit よりお問い合わせください。

How do I deposit a culture into the Protistology Collection?

See our Make a Deposit to inquire about depositing materials at ATCC.

「Type Strain（基準株）」とは何ですか?

動物命名規約によると、出版物に新しい分類単位を掲載する場合、著者は既に保存されている特定の見本を基準として命名しなければならないとのことです。規約には基準株の概念が記されているわけではありません。ATCCでは当初、基準となる標本が得られた場合にauthentic culture（本物の株）という用語を採用して付与しておりました。その後、保存機関同士の混乱を防ぐための試みとして、authentic culture（本物の株）という名前を"type strain"（基準株）として変更することになりました。

What is a "type strain"?

According to the Zoological Code of Nomenclature, when a new taxon is described in a publication, the author must designate a specific preserved specimen as the type. The concept of a type strain is not recognized by the Code. Therefore, we originally adopted the term authentic culture to refer to the culture from which the type specimen was obtained. In an attempt to avoid confusion between collections, authentic culture has now been changed to "type strain" (with quotation marks).

凍結状態でATCC株を受け取った場合、どうしたらよいですか?

商品が到着したらすぐに作業を開始されることをATCCでは推奨いたします。凍結アンプルをドライアイスから抜き取り、すぐに35℃のウォーターバスへ移してください。溶解したサンプル全量を、推奨の培地が入っている一枚の小さい培養容器（組織培養用フラスコT-25, スクリューキャップの試験管16×125mm、寒天プレート地など）へ添加し、適切な温度で培養してください。

もしサンプルをすぐに処理することが出来ないということであれば、液体窒素に保存していただくことを推奨いたします（-130℃以下）。代わりの保存法としては、1-5日という短期間であれば凍結サンプルを-70～-80℃の冷凍庫で保存することも可能です。-130℃もしくはそれ以下の温度で保存された凍結状態であれば、長期保存が可能です。-80℃から-130℃の間までの温度で保存されていた株の育成能は、使用された凍結保存用溶剤と、株自体の性質により、かなり幅が広く、経験的にしか判断できません。

研究者の方は、凍結商品なので-20℃（よく家庭で使用される冷凍冷蔵庫の冷凍庫部分で）で保存してしまう、という間違いが一般的によく起こります。絶対にこのような条件では保存しないでください。例え短時間でも、このような温度で保存をされた場合には、確実にサンプルは死滅してしまいます。

How do I handle frozen ATCC cultures upon receipt?

We recommend that the material be processed immediately upon arrival; remove the frozen ampule from the dry ice and quickly transfer it to a 35^oC water bath. Add the entire thawed contents to a single small culture vessel (T-25 tissue culture flask, 16 x 125 mm screw-capped test tube, agar plate, etc.) of the recommended medium and incubate at the appropriate temperature.

If the material cannot be processed immediately, we recommend that it be stored in a liquid nitrogen refrigerator (temperatures below -130^oC). Alternatively, the frozen material can be stored in a mechanical freezer between -70 and -80^oC for short periods (1 to 5 days). Frozen cultures are stable in the long term only when stored at -130^oC or below. Viability of cultures stored between -80 and -130^oC will vary with the nature of the cryoprotective agent and the strain and can only be determined empirically.

One of the most common mistakes that users make in storing frozen material is to place it at -20^oC (the freezer compartment of a conventional refrigerator-freezer). Never store frozen cultures in this manner. Storage at this temperature for even short periods will result in certain death of the culture.

1バイアル中に、どのくらいの細胞数が含まれているのでしょうか?

乾燥状態、凍結乾燥状態、もしくは凍結されたバイアル中の細胞の密度は、通常はご提供しておりませんが、ほとんどの場合において、御依頼をいただければご提供させていただきます。

What is the concentration of cells in the shipped vials?

Although the concentrations of the cells in dried, freeze-dried, and frozen vials is not routinely provided, in most cases this information can be obtained upon request.

原生生物が出荷される際のバイアル中には、餌としての他のバクテリアなどが加えられているのですか?

自由生活形態の単細胞原生生物は、彼らの生存する自然環境から手で分離されます(例えば、マイクロピペッターを使用して手で個々の細胞を捕獲することができます)。この手法では、原生生物の生育環境にもともと存在している野生細菌の細菌フローラを必ずしもすべて排除しているとは限りません。新しくクローン化された単細胞原生生物の培養で、餌となる微生物を供給するとき（単一分離された一種類のバクテリアが餌としてえられます）。一種類の菌種からなるバクテリア群集の巨大な集団が餌としてのバクテリアを構成しているのではないかと考えています。

Are there other bacteria in addition to the food source present when a protistology culture is shipped?

Free living, monoprotist cultures are isolated from their natural environment manually (i.e., individual cells are picked out by hand using a micro-pipettor). This method, in no way, assures that the natural bacterial flora from the protist's original environment is eliminated. When the new, clonal monoprotist culture is fed, (that results from the single, isolated cell with a single-strain bacterial food source) we expect that the vast majority of the bactrial population to be of the one strain making up the bacterial food source.

ATCC株を培養する際によくある失敗例はありますか?

バイアルに含まれるサンプル全べてを使用しなかった。

カタログで推奨されている培地を使用しなかった。

推奨温度で十分な時間培養されていない。

バイアルから取り分けた菌を、直接大容量の培地へ植菌して培養してしまった。

サンプルは、まず最初に少量の培地(5-10ml)もしくは一枚のプレート上で培養を開始してください。その後、徐々に培養スケールを上げて培養量を増やすことは可能です。

What are some of the common causes for failing to revive ATCC cultures?

The entire content of the vial was not used as the starting inoculum.

The medium specified in the catalog was not used.

There was insufficient incubation time at the recommended temperature.

The content of the vial was diluted into too great a volume.

A culture should first be established in a small volume (5 to 10 ml) or on a single plate. The culture volume can then be progressively scaled up as required.

カタログに記載されている培地以外の代替品で培養することも可能ですか?

ほとんどのケースにおいて、菌株は各種幅広い培地で生育するでしょう。ATCCが微生物を培養するために使用している培地は、寄託者の方から指定された培地です。全ての、遺伝子型や形質的特徴を維持するために、ATCCでは寄託者からの指示のある培地を使用しています。しかしながら、これまでに使用していた培地添加物が入手不可能になった場合など、新しい培地を採用しなければならなかったということはございます。

もし代替となる培地の利用を希望される場合には、指定培地とご希望の培地を同時にお試しいただくことを推奨します。なお、代替品の保証対象についての注意点としては、カタログに記載されている培養手順すべてに従って御利用いただいた場合にのみ、保証対象となりえることを予めご承知ください。

Can another medium be substituted for the one recommended in the catalog?

In many cases a specific protist will grow on a variety of media. The medium we use to propagate the organism is often what the depositor has specified. In most cases we continue to use the depositor's recommended medium to ensure that all of the genotypic and phenotypic characteristics of the strain will be maintained. However, in some cases we have had to employ a new medium when certain components of a previously used medium are no longer available.

If you wish to try an alternative medium, we recommend growing the culture on both the medium specified in the catalog and the substitute simultaneously. It should be noted that replacement cultures can only be obtained if all propagation procedures stated in the catalog were followed.

ATCCでの原虫の凍結保存方法を教えて下さい。

多様な原生生物を扱っているために、標準的な手順としてご説明することはとても難しい状況ですが、とても一般的な手法として下記を紹介いたします。

対数増殖期の後期もしくは増殖が停止するまで、原生生物を最適化された培地条件下で培養してください。

もし液体培地を使用するのであれば、濃縮する場合には遠心操作を行って上清を除去してください。

同じ培養用培地少量で再懸濁し、それと等量の2倍濃度の凍結保存用溶液(新しい培地で調整したもの)を加えてください。

また、スラント寒天培地上で生育した原生生物は、適切な培地で洗い落してそれと等量の2倍濃度の凍結保存溶液を加えてください。

等量づつプラスチック製の小バイアルへ入れて凍結してください。凍結の際には、室温から-40℃となるまで温度コントロールが出来る装置を使用して凍結するようにしてください。その後、液体窒素で保存するようにしてください。液体窒素タンク内で保存していただくことで長期の保管が可能となります。

What methods for cryopreservation of protists are used at ATCC?

It is very difficult to generalize because we deal with a tremendous diversity of protists. The following is a very general scheme.

Grow cells to late log or early stationary phase under optimal conditions in the medium of choice.

If a broth culture is used, centrifuge to concentrate the cells. Remove the supernatant.

Resuspend the cells in a smaller volume of the same growth medium, and add an equal amount of 2^x cryoprotective solution (the 2^x cryoprotective agent is prepared in fresh culture medium).

If cells were grown on agar slants, wash off the cells with the appropriate broth and add an equal amount of 2^x cryoprotective solution.

Aliquot into small plastic vials and freeze. Using a controlled rate freezing apparatus, cool from room temperature to -40^oC. Then plunge the ampules into liquid nitrogen; store in a liquid nitrogen unit to assure long-term viability.

原生生物を凍結保存するための温度制御機能のある装置がありません。代わりとなる安価な凍結方法を教えてください?

温度コントロールが出来る装置をお持ちでない場合、冷却サイクルが約1℃/1分となる市販の安価な容器が販売されています。(商品名：ミスターフロスティー, Cat. #5100; 日本国内販売元Nalge Nunc International K.K.).

If a controlled rate freezing apparatus is not available, is there an inexpensive alternative method for cryopreserving strains?

If a controlled rate freezing apparatus is not available, a cooling cycle which closely approximates a -1 C^o/min cooling rate can be achieved using a relatively inexpensive commercially available device (Cryo 1^oC Freezing Container, Cat. #5100; Nalgene Company, Rochester, NY 14606-0365).

95% fetal calf serum および 5% DMSO は凍結培地として使用することが可能ですか?

たとえこのような培地で凍結保存が出来たとしても、その凍結用培地の中に含まれている他の何らかのものが容易に持ち込まれることから、ATCCではFCSを凍結保存用培地の一部として使用することは推奨しません。

これは、凍結時の培養液中に持ち込まれたバクテリアが、原生生物の生育速度以上に早く増殖してしまうため、原生生物の生育を阻害してしまうからです。

Can 95% fetal calf serum and 5% DMSO be used as a freeze medium?

ATCC does not recommend using fetal calf serum as part of the cryoprotectant medium; even if the cryopreservation is successful, the bacteria frozen in such a medium would overtake anything else in the post-freeze culture so quickly that no protists would survive.

原虫は液体窒素で保存すべきですか?もしくは液体窒素で瞬時に凍結した後、-80℃で保存しても良いでしょうか?

全ての原生生物は、長期の保存のためには液体窒素中に保存しなければなりません。-80^oCでの保管は生育能を損なう可能性があります。

Do the protists have to be stored in liquid nitrogen or is it enough to flash freeze them in liquid nitrogen and store at -80^oC?

All protists must be stored in liquid nitrogen for long-term storage. Any storage at -80^oC will compromise the viability of the organism.