IVISbrite（旧RediFect）Lentiviral Particles
IVISbrite（旧RediFect）Lentiviral Particlesは、自己複製（ウイルス粒子）能力を欠いた遺伝子組み換えレンチウィルス粒子です。 安定的な遺伝子発現が可能なUbCプロモーターの制御下に、赤色シフトしたホタルルシフェラーゼ（Luciola italica）または緑色シフトしたRenillaルシフェラーゼ（Renilla reniformis）の遺伝子が導入されています。 IVISbrite（旧RediFect）レンチウイルス粒子は、大部分の癌細胞株、プライマリー細胞、幹細胞および非分裂細胞など幅広い種類の哺乳類細胞に迅速かつ効率的な形質導入が可能です。 腫瘍成長のモニター、プライマリー細胞または幹細胞のin vivoでの追跡、およびIVIS in vivoイメージングシステムを使ったさまざまなアプリケーションに使用できる安定的に形質導入した細胞を作製できる最も簡便な方法です。 主な特長
IVISbrite（旧RediFect）Red-FLuc-PuromycinIVISbrite（旧RediFect）Red-Fluc-Puromycinは、安定的な遺伝子発現が可能なUbCプロモーターの制御下に、赤色シフトしたホタルルシフェラーゼ（Luciola italica）の遺伝子が導入されています。 ホタルルシフェラーゼ導入遺伝子は、ピューロマイシン耐性遺伝子と効率よく共発現させるため、T2A「自己切断型」リンカーペプチドを介して融合されています。 レンチウイルス粒子は、Vesicular Stomatitis Virus（VSVG）由来のG糖タンパク質で偽型化されているため、大部分の癌細胞株、プライマリー細胞、幹細胞および非分裂細胞など幅広い種類の哺乳類細胞に効率的な形質導入が可能です。
IVISbrite（旧RediFect）Red-FLuc-GFPIVISbrite（旧RediFect）Red-Fluc-GFPは、安定的な遺伝子発現が可能なUbCプロモーターの制御下に、赤色シフトしたホタルルシフェラーゼ（Luciola italica）の遺伝子が導入されています。 ホタルルシフェラーゼ導入遺伝子は、Green Fluorescent Protein（GFP）遺伝子と効率よく共発現させるため、T2A「自己切断型」リンカーペプチドを介して融合されています。 レンチウイルス粒子は、Vesicular Stomatitis Virus（VSVG）由来のG糖タンパク質で偽型化されているため、大部分の癌細胞株、プライマリー細胞、幹細胞および非分裂細胞など幅広い種類の哺乳類細胞に効率的な形質導入が可能です。
IVISbrite（旧RediFect）Green-RenLuc-PuromycinIVISbrite（旧RediFect）Green RenLuc-Puromycinは、安定的な遺伝子発現が可能なUbCプロモーターの制御下に、緑色シフトしたRenillaルシフェラーゼ（Renilla reniformis）の遺伝子が導入されています。 緑色Renillaルシフェラーゼ導入遺伝子は、ピューロマイシン耐性遺伝子と効率よく共発現させるため、T2A「自己切断型」リンカーペプチドを介して融合されています。 レンチウイルス粒子は、Vesicular Stomatitis Virus（VSVG）由来のG糖タンパク質で偽型化されているため、大部分の癌細胞株、プライマリー細胞、幹細胞および非分裂細胞など幅広い種類の哺乳類細胞に効率的な形質導入が可能です。
発光・蛍光細胞作作製用レンチウィルス粒子
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| 誓約書 |
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 発光・蛍光細胞作作製用レンチウィルス粒子「IVISbrite（旧RediFect）Lentiviral Particles」の取り扱いに関する誓約書 |
関連情報
| 名称 | 資料 |
|---|---|
| RediFect Lentiviral Particles Transfection Protcol | |
| In Vivo Solutions eBook | |
| View peer reviewed publications using PerkinElmer's In Vivo Imaging Reagents | Link（PerkinElmerサイト） |
| View complete list of in vivo webinars available on demand | Link（PerkinElmerサイト） |
遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律第二十六条第一項に基づく情報提供書
当製品は、「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」（通称カルタヘナ法）における「研究開発等に係わる遺伝子組換え生物等の第二種使用等」に相当します。
ご使用の際は、「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律第二十六条第一項に基づく情報提供書」を確認の上、法令で定められた「拡散防止措置」等の措置を執り当製品の取扱を行って頂けますようお願い申し上げます。
製品一覧
（保存条件は下記の全製品－80℃となります）
| 型番 | 製品名 | 関連情報 | 容量 | 価格（税抜）※ |
|---|---|---|---|---|
| CLS960002 | IVISbrite（旧RediFect）
Red-FLuc-Puromycin |
Tec SheetSDS情報提供書 |
200μL | NEW 330,000 |
| CLS960003 | IVISbrite（旧RediFect）
Red-FLuc-GFP |
Tec SheetSDS情報提供書 |
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| CLS960004 | IVISbrite（旧RediFect）
Green-RenLuc-Puromycin |
Tec SheetSDS情報提供書 |
FAQ
Q1. Lentiviral transduction particlesの力価はどのくらいですか？
各バイアルには200ulのPBSで再懸濁された1x107 units/mLのlentiviral particlesが含まれています。
Q2. どのくらいのウイルス量が必要ですか？
効果的なトランスフェクションに必要なウイルスの量を知るためには、実際に目的の細胞で行う必要があります。目的の細胞に必要な量を知るためには、ウイルス滴定を行うことをお勧めします。まずはMOIの範囲を10～100倍に設定して行うことを推奨します。この範囲以上になると、細胞によってはレンチウイルスが毒性を示すことがあります。
Q3. レンチウイルスはゲノムのどこにshRNAを挿入しますか？
一般的にはランダムにゲノムに組み込まれると考えられています。しかしながら、レンチウイルスは活性化されている遺伝子に挿入するという文献もあります。
Q4. 購入したレンチウイルスの量で、どのくらいの細胞を感染させることができますか？
感染する細胞の量は、お使いの細胞株によって異なります。初代細胞や取り扱いの難しい細胞などは、より多くのレンチウイルスを要する可能性があります。必要に応じて、細胞の数を減らしMOIを増やすことをお勧めします。
Q5. Puromycinで選択を行ったら細胞が全滅してしまいましたが、なぜでしょうか？
お使いの細胞がpuromycin感受性を持つ可能性があります。加えたpuromycinの量が高すぎたと思われますので、用いる細胞を選択された際は、毎回、形質転換された細胞を効果的に選択するために必要なpuromycinの最少濃度を決定するための検討実験を行うことをお勧めします。また、必ずトランスフェクションしてから24～48時間経過した後に抗生物質を添加するようにしてください。細胞によっては、MOIを高めに設定したり、その他の形質転換を高めるような方法を行うことが必要になる場合もあります。
Q6. Puromycin滴定（kill curve）の方法を教えてください。
96wellプレートに1x104細胞を120mLの新しい培養液で播種します。翌日、500～10,000ng/mLのpuromycin加えます。2～4日間培養し、各日ごとにviabilityを測定します。2～4日観察し、全ての細胞が死滅したpuromycin濃度の中で最少の値を使用するようにしてください。
Q7. 抗生物質を使った選択がGFPを使った蛍光ソーティングよりも優れている点を教えてください。
形質転換された細胞の選択はpuromycinやGFPをレポーターとしたFACSのどちらでも行うことができ、どちらも効果的です。しかしながら、完全に形質転換された細胞だけを選択するためには、purocycinを使うことをお勧めします。
Q8. Polybrene感受性細胞株に使用できる代替品はありますか？
あります。いくつかの細胞株ではpolybrene毒性が確認される可能性があります（例えば間葉幹細胞など）。Fibronectinを代替試薬として使用している研究室もあります。
Q9. どのくらいのコピー数が期待できますか？
いくつかの細胞株ではより高い濃度のウイルスを必要とする場合があります。多くの研究者は1細胞につき1コピーになることを期待しますがコピー数は各細胞株によって異なりますので、実際に測定してみる必要があります。
Q10. 同じようなプラスミドの扱いがありますか？
残念ながらありません。現在のところプラスミドの販売は行っていません。
Q11. Lentiviral particleより直接ベクターを取り出すことはできますか？
できません。このベクターは製品、もしくは生成細胞を作るために使われています。ウイルスのゲノムはpLKO.1の5'と3'LTRの間に位置するRNAだけを含んでいます。（promoter, ReLuc配列に加えてpuromycin耐性遺伝子もしくはGFPを含みます。）
Q12. Lentiviral particleをラボで増やすことはできますか？
できません。ウイルス粒子は複製能力のないもののため増やすことができません。この粒子は第2もしくは第3世代のレンチウイルスパッケージングシステムの特徴を使って作られています。複製のために必要となる遺伝子や構造タンパク質が欠損した状態でパッケージングされており、パッケージング細胞の中の他のプラスミドによって補完されています。ウイルスのゲノムはプラスミドの5'と3'のLTRの間の部分のみしか持っていません。加えてレンチウイルスベクターは、いったん宿主染色体と統合すると感染するウイルスを作り出すことができなくなる自己不活性化3' LTRを持っています。
Q13. レンチウイルスを作るために使われているパッケージングシステムは何ですか？
第3世代パッケージングシステムです。
Q14. レンチウイルスのバイオセーフティーについてどのくらい注意するべきですか？
HIVに感染する可能性はありますか？ ウイルスベクターシステムは安全性を高めるように改良されています。第3世代のシステムでは次のように定義されます。
- パッケージングベクターはレンチウイルス遺伝子の最小のセットしか持っておらず、ウイルス粒子の構造タンパク質やこん包された機能が必要となります。
- 偽型にするための異種のエンベロープを供給する水疱性口内炎ウイルス G-タンパク（pCMV-VSV-G）エンベロープベクターを使用しています。
- RNAの生成とパッケージを行うために必要なシスエレメントと同様の役割を果たす配列を含むトランスファーベクター。マルチプラスミドの手法を取ることにより、レンチウイルスを作り出すために必要な全ての遺伝子を持つプラスミドが存在しません。
このため、複製能力がないことに加えて、3'LTRのU3にあるエンハンサー/プロモーター領域を削除してあるため、更にウイルス複製の可能性が少なくなっています。このシステムはshRNAのパッケージングに必要ないウイルス由来の遺伝子を取り除いています。これらの特徴によって、安全性と操作性をより高めています。バイオセーフティーを高めた第3世代のレンチウイルスシステムをご使用になることをお勧めします。第3システムがコンピテントウイルスを作り出すかどうかは知られていませんが、所定のレンチウイルス操作を行う時には、複製能力を持っていないかどうかをモニターする事は重要です。NIHガイドラインでは、複製能力のないレンチウイルス粒子はRisk Group-Level 2（RGL2）で取り扱うことを推奨しています。加えて、地域、州、もしくは国のレギュレーションに従ってください。
Q15. RedLucベクターはHIVをもとにしたベクターですか？もしそうであれば、バイオセーフティーに関する問題はありますか？
RedLuc ベクターはレンチウイルス（HIV）を基にしたプラスミドです。ベクターはバイオセーフティーレベル2に該当します。また、一度宿主細胞に感染したらウイルスを作り出せないように改良されているため（HIVの毒性に関与する遺伝子の決失、ウイルス粒子の最少ゲノム情報しか持っていない、複製できない、自己不活性化による）、安全に使うことができます。お客様の施設のバイオセーフティーに関する部署に、特別な対応が必要かどうか相談するようにしてください。
Q16. レンチウイルスを使った実験のためにラボを改装する必要がありますか？
レンチウイルスを利用する場合、NIHではBSL-2 standardsの実験室で扱うことを推奨しています。お客様の施設のバイオセーフティーに関する部署に、特別な対応が必要かどうか相談するようにしてください。
